분열 효모의 염색체 통합을 위한 벡터 및 균주 세트

Nov 30, 2023

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 9295(2023) 이 기사 인용

측정항목 세부정보

이종 유전자의 발현은 효모 유전학에서 중요한 기술입니다. 분열 효모에서는 leu1과 ura4 유전자가 주로 이종 발현을 위한 선별 마커로 사용되어 왔습니다. 유전자의 이종 발현에 사용할 수 있는 선택 마커의 레퍼토리를 확장하기 위해 여기서는 lys1 및 arg3을 사용하는 새로운 호스트-벡터 시스템을 개발했습니다. CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 게놈 편집을 사용하여 우리는 각각 ORF 영역에 중요한 돌연변이가 있는 lys1 및 arg3의 여러 대립 유전자를 분리했습니다. 동시에, 우리는 각 유전자좌에 통합될 때 lys1 및 arg3 돌연변이의 아미노산 영양요구성을 보완하는 벡터 세트를 개발했습니다. 이전에 개발된 통합 벡터 pDUAL과 함께 이러한 벡터를 사용하여 우리는 세 가지 단백질을 서로 다른 형광 단백질과 융합하여 세포 내에서 동시에 위치를 관찰하는 데 성공했습니다. 따라서 이러한 벡터는 이종 유전자의 조합 발현을 가능하게 하며, 이는 점점 더 다양한 실험 과제를 해결합니다.

효모 생물학에 대한 연구는 다양한 생물학적 현상의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝히기 위한 정교한 실험 시스템의 개발을 촉진했습니다. 최근에는 이러한 분자 메커니즘을 더 깊이 탐구하기 위해 복잡한 실험 시스템이 필요한 경우가 있습니다. 많은 경우 이러한 복잡한 실험에는 세포 내 여러 이식유전자의 발현이 필요합니다. 이를 위해 에피솜 플라스미드 또는 통합 벡터와 구성적 또는 유도성 프로모터로 사용할 수 있는 여러 벡터가 개발되었습니다1, 2. 생리학적 환경과 유사한 조건을 재현할 수 있는 발현 시스템이 선호됩니다. 이러한 의미에서 통합 벡터의 사용은 에피솜 벡터보다는 효모 생물학에 사용되는 최첨단 시스템 중 하나입니다3.

우리는 이전에 단일 교차 재조합에 의한 염색체 통합에도 사용할 수 있는 두 가지 유형의 에피솜 벡터를 개발했습니다4, 5. 벡터의 한 유형은 lys1, arg1 또는 his3 유전자좌에 통합되도록 설계되었습니다. 이들 벡터가 표적 유전자좌에 성공적으로 통합되면, 형질전환체는 상응하는 아미노산에 대해 영양요구성이 됩니다. 이들 벡터의 장점은 아미노산 영양요구성이 없는 균주에도 사용할 수 있다는 점이다. 따라서 많은 경우 새로운 숙주 균주를 준비하지 않고도 이들 벡터를 사용할 수 있다. 그러나 벡터를 게놈에 통합하면 아미노산 영양요구성이 발생한다는 사실이 어떤 경우에는 단점이 됩니다. 반면, pDUAL 시리즈 벡터는 leu1 locus4에 통합되도록 설계되었습니다. leu1-32 대립유전자를 갖는 균주에만 사용할 수 있지만, 형질전환체는 류신에 대해 원영양화되어 형질전환체를 쉽게 선택할 수 있습니다(그림 1). pDUAL 벡터가 leu1 유전자의 기능적 복사본을 포함하지 않는다는 사실은 플라스미드가 게놈에 무작위로 통합되는 형질전환체의 선택을 방지합니다. 두 가지 유형의 벡터 모두 장단점이 있지만, 적절한 형질전환체의 선택 및 유지 측면에서 pDUAL 유형의 벡터가 더 유용한 것으로 보입니다.

leu1-32 돌연변이의 게놈에 pDUAL의 통합. pDUAL 시리즈 벡터는 leu1 ORF 영역 내에 제한 효소 인식 부위를 포함하는 leu1 유전자의 일부를 가지고 있습니다. 단일 교차 재조합이 leu1-32 대립 유전자의 돌연변이 지점 하류에서 발생하면 결과 게놈에는 leu1의 두 복사본이 있을 것으로 예상됩니다. 하나는 3' 부분이 결여되어 있고 다른 하나는 전체 길이의 기능성 유전자입니다. 회로도는 확장되지 않습니다.

본 논문에서는 pDUAL 유형의 단일 교차 재조합 전략을 고려하여 leu1 이외의 유전자좌를 표적으로 하는 새로운 호스트-벡터 시스템을 개발하려고 했습니다. 핵분열 효모6에서 최근 개발된 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 우리는 lys1 또는 arg37, 8에서 중요한 프레임 이동 돌연변이가 있는 균주를 성공적으로 분리했습니다. 또한 염색체에 표적화된 통합 시 이러한 돌연변이의 아미노산 영양요구성을 보완할 수 있는 벡터를 구축했습니다. 이전에 개발된 pDUAL 벡터와 함께, 이제 약물 내성 마커를 사용하지 않고도 원영양생물 형질전환체에서 3개의 이식유전자를 발현할 수 있습니다.